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顯微熒光光譜成像系統(tǒng)的組成

顯微熒光光譜成像系統(tǒng)（MFSIS）包括以下幾個(gè)部分：光源，分光系統(tǒng)，熒光顯微鏡，圖像適配器，高性能制冷CCD攝像器件，圖像采集卡，圖像生成與處理、圖像顯示等，系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1   顯微熒光光譜成像系統(tǒng)結(jié)構(gòu)

工作過程：高功率單色激發(fā)光源激發(fā)顯微鏡下樣品，使之發(fā)射出特定的生物熒光.依據(jù)Stocks定律，熒光波長(zhǎng)大于激發(fā)光波長(zhǎng)，采用光譜分光元件可以從光譜上將二者分開。在系統(tǒng)中可以通過對(duì)線性可變單色濾光片LVF的精確位移控制實(shí)現(xiàn)光譜分辨。通過LabVIEW軟件控制系統(tǒng)硬件改變其位置，并觸發(fā)圖像采集系統(tǒng)同步工作，即可獲取序列圖像—光譜圖像立方體。采集圖像信號(hào)并進(jìn)行處理后，就能夠獲取微區(qū)熒光光譜掃描譜圖的詳細(xì)信息。使用在NI視覺開發(fā)模塊的基礎(chǔ)上所開發(fā)的顯微熒光光譜分析軟件能夠?qū)Σ杉瘉淼膱D像進(jìn)行相關(guān)圖像處理與光譜信息分析。

顯微熒光光譜成像系統(tǒng)主要有三大功能模塊構(gòu)成：基于LVF的分光系統(tǒng)控制模塊、序列圖像采集模塊和光譜圖像處理與分析模塊。

分光系統(tǒng)控制模塊

    光譜儀器的核心部分是色散系統(tǒng)，這是因?yàn)楣庾V儀器的四個(gè)最主要的基本特征即工作光譜范圍、色散率、分辨率和集光本領(lǐng)都決定于色散系統(tǒng)。本系統(tǒng)采用美國(guó)OCEAN公司的線性可變?yōu)V光片(LVF)作為色散元件，實(shí)現(xiàn)光譜阻斷或者通過。

分光系統(tǒng)的軟件部分主要是利用LabVIEW的串口工具來控制LVF的運(yùn)動(dòng)。主要功能包括：

※ 系統(tǒng)復(fù)位

※ 往復(fù)運(yùn)動(dòng)與指定波長(zhǎng)位置

※ 步進(jìn)工作：按照給定的間隔步長(zhǎng)，由按鍵控制電機(jī)步進(jìn)

※ 行程控制與精確定位

軟件系統(tǒng)中的控制窗口如圖2所示。運(yùn)行時(shí)的操作過程為：給定set value的值，電機(jī)可以直接運(yùn)行到指定的波長(zhǎng)值，并且在current wavelength處實(shí)時(shí)顯示當(dāng)前波長(zhǎng)，然后根據(jù)給定的step值，點(diǎn)擊step按鈕，進(jìn)行電機(jī)的步進(jìn)。根據(jù)需要，可以隨時(shí)進(jìn)行中斷并復(fù)位。運(yùn)行過程中，通過busy指示燈控件反映運(yùn)行的信息，當(dāng)程序運(yùn)行正常時(shí)，指示燈閃爍，提示等待信息；當(dāng)程序發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤時(shí)，指示燈停止閃爍，提示欄會(huì)提示錯(cuò)誤原因。以便及時(shí)更正錯(cuò)誤信息。

圖2  分光系統(tǒng)的控制

序列圖像采集模塊

顯微序列圖像的采集采用了美國(guó)Pixera公司的150CL型高性能冷CCD，配備圖像采集卡，但是該卡無LabVIEW驅(qū)動(dòng)程序。本文中利用LabVIEW的DLL動(dòng)態(tài)函數(shù)調(diào)用功能，通過對(duì)Pixera公司提供控制SDK包的調(diào)用，實(shí)現(xiàn)了圖像采集的曝光時(shí)間設(shè)置、自動(dòng)增益調(diào)節(jié)、自動(dòng)對(duì)焦、積分時(shí)間調(diào)整、黑/白平衡、彩色/灰度切換以及CCD靈敏度設(shè)置等多項(xiàng)功能。本文設(shè)計(jì)了圖像采集的必備子VI，其中包括CCD驅(qū)動(dòng)、圖像靈敏度、制冷控制、熒光快速模式等，并將CCD采集到的圖像數(shù)據(jù)自動(dòng)存入一臨時(shí)文件，采用ReadFile子VI，讀取該JPEG格式的圖像文件，顯示在位于面板右側(cè)的圖片顯示區(qū)中。

除采用軟件控制外，通過一個(gè)手動(dòng)按鈕控件。控制采集卡的圖像CCD采集工作，自動(dòng)完成圖像數(shù)據(jù)采集、存儲(chǔ)和顯示。此系統(tǒng)工作簡(jiǎn)便，快速，實(shí)時(shí)性強(qiáng)，能夠很好地配合整個(gè)系統(tǒng)工作。

光譜圖像模塊

    顯微熒光光譜曲線的繪制是本系統(tǒng)的特點(diǎn)之一。如圖3所示，經(jīng)過光譜掃描得到的序列圖像形成光譜立方體，其中從第0幅圖到第i幅圖分別對(duì)應(yīng)不同的波長(zhǎng)值，居于圖像中心的像素波長(zhǎng)值分別為：λ00，λ00，……，λ0i。對(duì)于每幅圖象任意像素點(diǎn)，通過光譜計(jì)算可以確定其對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)值和光強(qiáng)度值，由此實(shí)現(xiàn)繪制圖像上任意點(diǎn)的光譜曲線。

圖 3  序列圖像的光譜構(gòu)成

以下以FluorCell#2熒光分子探針顯微熒光光譜成像為例。首先在鏡下調(diào)整成像的照明、CCD靈敏度、手動(dòng)調(diào)焦，選擇需要細(xì)節(jié)觀察的細(xì)胞區(qū)域。然后設(shè)定光譜立方體所需要的熒光采集參數(shù)、波長(zhǎng)步進(jìn)值、圖像內(nèi)存區(qū)、光譜分光速度等，啟動(dòng)序列圖像采集，系統(tǒng)將自動(dòng)按照設(shè)定波長(zhǎng)獲取相應(yīng)的光譜圖像序列，并將之存儲(chǔ)在指定目錄下，該目錄自動(dòng)設(shè)定為當(dāng)前年月日時(shí)分，采集完成后可按照要求更改。系統(tǒng)工作界面如圖4：

圖４　Fluorcell#2的光譜圖像采集

完成圖像立方體采集后，選擇任意波長(zhǎng)圖像上感興趣的一個(gè)區(qū)域，然后通過計(jì)算，以該區(qū)域上每個(gè)像素點(diǎn)的強(qiáng)度中值或平均值為縱坐標(biāo)，波長(zhǎng)值為橫坐標(biāo)，便繪制出了光譜曲線，也稱為“面域光譜”，如上圖中右下角曲線中的白點(diǎn)。所選定的區(qū)域還會(huì)被標(biāo)記在系統(tǒng)的顯示面板上。

此外，考慮到圖像立方體中圖像的個(gè)數(shù)有限，容易造成曲線的不平滑。所以，我們對(duì)光譜曲線進(jìn)行擬合，采用三次樣條內(nèi)插的方法，使整個(gè)曲線看起來更加平滑。如圖中右下方的曲線中紅線。

除光譜曲線繪制的功能外，軟件還增加了一些基本的圖像處理功能，用來針對(duì)圖像立方體中某一幅圖像進(jìn)行處理。主要有以下功能：彩色圖像顯示，RGB直方圖，RGB閾值分割，灰度圖顯示，三維圖，反相圖，圖像增強(qiáng)（圖像均衡化，低通濾波，高斯濾波，平滑濾波），邊緣銳化（拉普拉斯），灰度直方圖，灰度閾值濾波，面積計(jì)算與統(tǒng)計(jì)，直線強(qiáng)度分布圖。此外，為了方便對(duì)圖像立方體中圖像的整體了解，本系統(tǒng)設(shè)置了圖像的Flash顯示。即，按照一定的時(shí)間間隔，順序顯示多光譜圖像。從效果來看，類似動(dòng)畫播放，使觀察者對(duì)圖像上目標(biāo)的動(dòng)態(tài)信息變化有更好地了解。這種方法同樣可以應(yīng)用于細(xì)胞形態(tài)變化的觀察。

應(yīng)用實(shí)驗(yàn)

1．梔子提取物抗病毒性研究

中藥梔子性味苦寒、歸心肺三焦經(jīng)，能瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒，具通瀉三焦火邪的功效，是中醫(yī)藥用于治療溫毒疫病的要藥。病毒感染特性：病毒的感染有賴于病毒吸附蛋白(virus attachment protein，VAP )對(duì)細(xì)胞表面受體的吸附。病毒吸附蛋白是啟動(dòng)病毒與宿主細(xì)胞之間相互作用、建立感染損傷細(xì)胞的必然途徑。

病毒與細(xì)胞受體的結(jié)合可以用熒光標(biāo)記，將培養(yǎng)的人喉癌上皮傳代細(xì)胞Hep-2和病毒作用分為三組：

（1）實(shí)驗(yàn)對(duì)照組y1，只加病毒，不加藥

（2）先吸附，后加藥組y2

（3）先加藥，后吸附組y3

每組按照時(shí)間間隔2秒采集圖像，得到各組的時(shí)間序列圖像組，并利用熒光光譜分析系統(tǒng)對(duì)圖像組進(jìn)行分析：

1. 首先以兩秒為時(shí)間間隔，分別對(duì)三組細(xì)胞圖像進(jìn)行采集，各采10幅圖。
2. 然后對(duì)采集來的圖像進(jìn)行均衡化，平滑濾波以及高斯濾波。
3. 在濾波后的圖像上選擇目標(biāo)區(qū)域，并將所選區(qū)域以及該區(qū)域?qū)?yīng)的原始圖像區(qū)域進(jìn)行顯示與保存。
4. 對(duì)圖像進(jìn)行閾值濾波，以減去細(xì)胞外的背景信息。
5. 求得閾值濾波后細(xì)胞的像素面積。
6. 分別比較三種情況下細(xì)胞面積的變化。
   
             

圖５　Hep-2細(xì)胞抗病毒顯微光譜分析

如圖5所示，可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在只加入病毒，和同時(shí)加入病毒和藥物兩種情況下變化趨勢(shì)是不同的。前者，細(xì)胞在形態(tài)上沒有明顯的變化，而后者細(xì)胞在形態(tài)上都存在較大變化，呈變大的趨勢(shì)。因此，可以認(rèn)定加入梔子提取物對(duì)病毒的抑制作用很明顯。

2．茶葉熒光性綠斑病的研究

在日照、臨沂和泰安等地、市的茶園中，普遍發(fā)生一種茶樹成葉病害，其主要癥狀表現(xiàn)為：葉片下表皮局部異常凸起，呈綠色，而且病斑處在光照下能發(fā)綠色熒光，如圖6所示。

圖6  茶葉的綠斑病

通過對(duì)病害癥狀演化的系統(tǒng)觀測(cè)發(fā)現(xiàn)：此病害具有發(fā)綠色熒光的特性，且隨病害程度的加重，熒光增強(qiáng)，容易與其它一般病害的癥狀區(qū)分開來。所以，掌握和利用這一特性可以幫助我們正確辨認(rèn)此種病害。我們選定其中一病變區(qū)域的熒光測(cè)定光譜如圖7。

圖7   病變區(qū)熒光光譜

總結(jié)

顯微熒光光譜成像技術(shù)是顯微光譜成像技術(shù)中一種常用的方法，對(duì)于能夠產(chǎn)生自體熒光和激發(fā)熒光的物質(zhì)來說，顯微熒光光譜成像技術(shù)具有顯著的優(yōu)勢(shì)，包括無創(chuàng)性，可視性，精確性等特點(diǎn)。

本文基于LabVIEW軟件構(gòu)建的顯微熒光光譜分析系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了數(shù)字圖像采集、圖像處理及生物醫(yī)學(xué)中光譜圖像分析等功能。系統(tǒng)功能結(jié)構(gòu)復(fù)雜，所有工作在一年時(shí)間內(nèi)完成，相比MSDN來說，大大節(jié)約了開發(fā)時(shí)間，且界面清潔美觀、操作方便。