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顯微熒光光譜成像系統(tǒng)的組成

顯微熒光光譜成像系統(tǒng)（MFSIS）包括以下幾個部分：光源，分光系統(tǒng)，熒光顯微鏡，圖像適配器，高性能制冷CCD攝像器件，圖像采集卡，圖像生成與處理、圖像顯示等，系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1   顯微熒光光譜成像系統(tǒng)結(jié)構(gòu)

工作過程：高功率單色激發(fā)光源激發(fā)顯微鏡下樣品，使之發(fā)射出特定的生物熒光.依據(jù)Stocks定律，熒光波長大于激發(fā)光波長，采用光譜分光元件可以從光譜上將二者分開。在系統(tǒng)中可以通過對線性可變單色濾光片LVF的精確位移控制實現(xiàn)光譜分辨。通過LabVIEW軟件控制系統(tǒng)硬件改變其位置，并觸發(fā)圖像采集系統(tǒng)同步工作，即可獲取序列圖像—光譜圖像立方體。采集圖像信號并進行處理后，就能夠獲取微區(qū)熒光光譜掃描譜圖的詳細信息。使用在NI視覺開發(fā)模塊的基礎(chǔ)上所開發(fā)的顯微熒光光譜分析軟件能夠?qū)Σ杉瘉淼膱D像進行相關(guān)圖像處理與光譜信息分析。

顯微熒光光譜成像系統(tǒng)主要有三大功能模塊構(gòu)成：基于LVF的分光系統(tǒng)控制模塊、序列圖像采集模塊和光譜圖像處理與分析模塊。

分光系統(tǒng)控制模塊

    光譜儀器的核心部分是色散系統(tǒng)，這是因為光譜儀器的四個最主要的基本特征即工作光譜范圍、色散率、分辨率和集光本領(lǐng)都決定于色散系統(tǒng)。本系統(tǒng)采用美國OCEAN公司的線性可變?yōu)V光片(LVF)作為色散元件，實現(xiàn)光譜阻斷或者通過。

分光系統(tǒng)的軟件部分主要是利用LabVIEW的串口工具來控制LVF的運動。主要功能包括：

※ 系統(tǒng)復(fù)位

※ 往復(fù)運動與指定波長位置

※ 步進工作：按照給定的間隔步長，由按鍵控制電機步進

※ 行程控制與精確定位

軟件系統(tǒng)中的控制窗口如圖2所示。運行時的操作過程為：給定set value的值，電機可以直接運行到指定的波長值，并且在current wavelength處實時顯示當前波長，然后根據(jù)給定的step值，點擊step按鈕，進行電機的步進。根據(jù)需要，可以隨時進行中斷并復(fù)位。運行過程中，通過busy指示燈控件反映運行的信息，當程序運行正常時，指示燈閃爍，提示等待信息；當程序發(fā)現(xiàn)錯誤時，指示燈停止閃爍，提示欄會提示錯誤原因。以便及時更正錯誤信息。

圖2  分光系統(tǒng)的控制

序列圖像采集模塊

顯微序列圖像的采集采用了美國Pixera公司的150CL型高性能冷CCD，配備圖像采集卡，但是該卡無LabVIEW驅(qū)動程序。本文中利用LabVIEW的DLL動態(tài)函數(shù)調(diào)用功能，通過對Pixera公司提供控制SDK包的調(diào)用，實現(xiàn)了圖像采集的曝光時間設(shè)置、自動增益調(diào)節(jié)、自動對焦、積分時間調(diào)整、黑/白平衡、彩色/灰度切換以及CCD靈敏度設(shè)置等多項功能。本文設(shè)計了圖像采集的必備子VI，其中包括CCD驅(qū)動、圖像靈敏度、制冷控制、熒光快速模式等，并將CCD采集到的圖像數(shù)據(jù)自動存入一臨時文件，采用ReadFile子VI，讀取該JPEG格式的圖像文件，顯示在位于面板右側(cè)的圖片顯示區(qū)中。

除采用軟件控制外，通過一個手動按鈕控件。控制采集卡的圖像CCD采集工作，自動完成圖像數(shù)據(jù)采集、存儲和顯示。此系統(tǒng)工作簡便，快速，實時性強，能夠很好地配合整個系統(tǒng)工作。

光譜圖像模塊

    顯微熒光光譜曲線的繪制是本系統(tǒng)的特點之一。如圖3所示，經(jīng)過光譜掃描得到的序列圖像形成光譜立方體，其中從第0幅圖到第i幅圖分別對應(yīng)不同的波長值，居于圖像中心的像素波長值分別為：λ00，λ00，……，λ0i。對于每幅圖象任意像素點，通過光譜計算可以確定其對應(yīng)的波長值和光強度值，由此實現(xiàn)繪制圖像上任意點的光譜曲線。

圖 3  序列圖像的光譜構(gòu)成

以下以FluorCell#2熒光分子探針顯微熒光光譜成像為例。首先在鏡下調(diào)整成像的照明、CCD靈敏度、手動調(diào)焦，選擇需要細節(jié)觀察的細胞區(qū)域。然后設(shè)定光譜立方體所需要的熒光采集參數(shù)、波長步進值、圖像內(nèi)存區(qū)、光譜分光速度等，啟動序列圖像采集，系統(tǒng)將自動按照設(shè)定波長獲取相應(yīng)的光譜圖像序列，并將之存儲在指定目錄下，該目錄自動設(shè)定為當前年月日時分，采集完成后可按照要求更改。系統(tǒng)工作界面如圖4：

圖４　Fluorcell#2的光譜圖像采集

完成圖像立方體采集后，選擇任意波長圖像上感興趣的一個區(qū)域，然后通過計算，以該區(qū)域上每個像素點的強度中值或平均值為縱坐標，波長值為橫坐標，便繪制出了光譜曲線，也稱為“面域光譜”，如上圖中右下角曲線中的白點。所選定的區(qū)域還會被標記在系統(tǒng)的顯示面板上。

此外，考慮到圖像立方體中圖像的個數(shù)有限，容易造成曲線的不平滑。所以，我們對光譜曲線進行擬合，采用三次樣條內(nèi)插的方法，使整個曲線看起來更加平滑。如圖中右下方的曲線中紅線。

除光譜曲線繪制的功能外，軟件還增加了一些基本的圖像處理功能，用來針對圖像立方體中某一幅圖像進行處理。主要有以下功能：彩色圖像顯示，RGB直方圖，RGB閾值分割，灰度圖顯示，三維圖，反相圖，圖像增強（圖像均衡化，低通濾波，高斯濾波，平滑濾波），邊緣銳化（拉普拉斯），灰度直方圖，灰度閾值濾波，面積計算與統(tǒng)計，直線強度分布圖。此外，為了方便對圖像立方體中圖像的整體了解，本系統(tǒng)設(shè)置了圖像的Flash顯示。即，按照一定的時間間隔，順序顯示多光譜圖像。從效果來看，類似動畫播放，使觀察者對圖像上目標的動態(tài)信息變化有更好地了解。這種方法同樣可以應(yīng)用于細胞形態(tài)變化的觀察。

應(yīng)用實驗

1．梔子提取物抗病毒性研究

中藥梔子性味苦寒、歸心肺三焦經(jīng)，能瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒，具通瀉三焦火邪的功效，是中醫(yī)藥用于治療溫毒疫病的要藥。病毒感染特性：病毒的感染有賴于病毒吸附蛋白(virus attachment protein，VAP )對細胞表面受體的吸附。病毒吸附蛋白是啟動病毒與宿主細胞之間相互作用、建立感染損傷細胞的必然途徑。

病毒與細胞受體的結(jié)合可以用熒光標記，將培養(yǎng)的人喉癌上皮傳代細胞Hep-2和病毒作用分為三組：

（1）實驗對照組y1，只加病毒，不加藥

（2）先吸附，后加藥組y2

（3）先加藥，后吸附組y3

每組按照時間間隔2秒采集圖像，得到各組的時間序列圖像組，并利用熒光光譜分析系統(tǒng)對圖像組進行分析：

1. 首先以兩秒為時間間隔，分別對三組細胞圖像進行采集，各采10幅圖。
2. 然后對采集來的圖像進行均衡化，平滑濾波以及高斯濾波。
3. 在濾波后的圖像上選擇目標區(qū)域，并將所選區(qū)域以及該區(qū)域?qū)?yīng)的原始圖像區(qū)域進行顯示與保存。
4. 對圖像進行閾值濾波，以減去細胞外的背景信息。
5. 求得閾值濾波后細胞的像素面積。
6. 分別比較三種情況下細胞面積的變化。
   
             

圖５　Hep-2細胞抗病毒顯微光譜分析

如圖5所示，可以發(fā)現(xiàn)細胞在只加入病毒，和同時加入病毒和藥物兩種情況下變化趨勢是不同的。前者，細胞在形態(tài)上沒有明顯的變化，而后者細胞在形態(tài)上都存在較大變化，呈變大的趨勢。因此，可以認定加入梔子提取物對病毒的抑制作用很明顯。

2．茶葉熒光性綠斑病的研究

在日照、臨沂和泰安等地、市的茶園中，普遍發(fā)生一種茶樹成葉病害，其主要癥狀表現(xiàn)為：葉片下表皮局部異常凸起，呈綠色，而且病斑處在光照下能發(fā)綠色熒光，如圖6所示。

圖6  茶葉的綠斑病

通過對病害癥狀演化的系統(tǒng)觀測發(fā)現(xiàn)：此病害具有發(fā)綠色熒光的特性，且隨病害程度的加重，熒光增強，容易與其它一般病害的癥狀區(qū)分開來。所以，掌握和利用這一特性可以幫助我們正確辨認此種病害。我們選定其中一病變區(qū)域的熒光測定光譜如圖7。

圖7   病變區(qū)熒光光譜

總結(jié)

顯微熒光光譜成像技術(shù)是顯微光譜成像技術(shù)中一種常用的方法，對于能夠產(chǎn)生自體熒光和激發(fā)熒光的物質(zhì)來說，顯微熒光光譜成像技術(shù)具有顯著的優(yōu)勢，包括無創(chuàng)性，可視性，精確性等特點。

本文基于LabVIEW軟件構(gòu)建的顯微熒光光譜分析系統(tǒng)，實現(xiàn)了數(shù)字圖像采集、圖像處理及生物醫(yī)學中光譜圖像分析等功能。系統(tǒng)功能結(jié)構(gòu)復(fù)雜，所有工作在一年時間內(nèi)完成，相比MSDN來說，大大節(jié)約了開發(fā)時間，且界面清潔美觀、操作方便。