近日，頂級期刊《自然—通訊》發(fā)表論文報道了第三款CRISPR基因剪刀——CRISPR-Cas12b，這種新工具是第三個可以編輯人類細胞基因組的CRISPR-Cas系統(tǒng)，并很可能是更好的基因剪刀，將會帶給研究人員更多選擇與施展空間
第三款CRISPR基因剪刀論文作者是美國麻省理工學院—哈佛大學博德研究所教授張鋒，他也是CRISPR-Cas基因編輯系統(tǒng)的先驅(qū)者之一。此前，他已成功參與開發(fā)出Cas9系統(tǒng)、Cas12a系統(tǒng)，如今成功湊齊Cas12b——CRISPR基因剪刀的第三個潛在基因組編輯系統(tǒng)。
基因剪刀三兄弟
CRISPR-Cas9是目前科學家們最常用的多功能基因組編輯工具，但除此之外，Cas蛋白家族中的Cas12a和Cas12b也具備成為基因剪刀的潛力
此前，科學家們在實驗室最常用的多功能基因組編輯工具是CRISPR-Cas9，這是一種RNA導向的核酸酶，可以切割DNA。
Cas9系統(tǒng)最初由美國加州大學伯克利分校、瑞典于默奧大學和美國麻省理工學院—哈佛大學博德研究所張鋒等實驗室在2012年和2013年報道。該系統(tǒng)有效實現(xiàn)了哺乳動物基因組的編輯，并帶動了基因編輯領域迅猛發(fā)展，將基因編輯技術(shù)成功拓展到基因轉(zhuǎn)錄表達調(diào)控、表觀遺傳修飾、全基因組功能篩選、堿基編輯、基因組成像和細胞譜系追蹤等多種生物學應用。它能使基因組更有效地產(chǎn)生變化或突變，效率比既往基因編輯技術(shù)更高，這讓CRISPR成為“生物科學領域的游戲規(guī)則改變者”，如今發(fā)展成為該領域最熱門的研究工具之一。
然而，Cas9并非Cas蛋白家族中唯一一種RNA導向的核酸酶，除了Cas9之外，研究人員還發(fā)現(xiàn)Cas12a和Cas12b也具備成為基因剪刀的潛力。
其中，Cas12a已經(jīng)被開發(fā)成基因組編輯工具。張鋒等人在2015年發(fā)現(xiàn)并改造的Cas12a（又稱為Cpf1）系統(tǒng)能實現(xiàn)哺乳動物等多個物種的基因組編輯。而且與Cas9相比，Cas12a具有一定優(yōu)勢：它比標準的Cas9要小，更容易進入組織和細胞；它剪切時離識別位點很遠，這幫助研究人員在編輯位置的選擇上有了更多施展空間。
于是，在CRISPR基因剪刀的潛力者哥仨中，就剩下Cas12b（又稱為C2c1）仍未開發(fā)成功。這種蛋白比Cas9和Cas12a更小，更容易通過病毒載體實現(xiàn)細胞間遞送，所以很可能是更好的基因剪刀。
張鋒團隊的研究
Cas12b的最佳活性“工作環(huán)境”需要達到48℃，為此，張鋒團隊對Cas12b重新進行了設計，不但增強它在人體體溫37℃下的活性，甚至在編輯效率和低脫靶率上更為優(yōu)異
理想豐滿，現(xiàn)實骨感。由于Cas12b具有嗜高溫特性，很難開發(fā)成好用的基因編輯工具。作為DNA裂解酶，Cas12b來自一種嗜酸耐熱菌，它的最佳活性“工作環(huán)境”需要達到48℃。這種溫度對于普通哺乳動物來說，實在難以承受。而一旦達不到溫度要求，Cas12b的酶活性就不能發(fā)揮，會選擇罷工。
對此，張鋒團隊對Cas12b開展了研究。他們先在Cas12b蛋白家族中尋找到一種喜歡常溫的成員，并鑒定出在37℃時仍能保持核酸酶活性的BhCas12b。但實驗發(fā)現(xiàn)，原始結(jié)構(gòu)的野生型BhCas12b會切割雙鏈DNA中的非靶標單鏈，且溫度越低、錯誤越多，導致編輯效率較低。
為解決這一問題，張鋒團隊對Cas12b重新進行了設計，以增強它在人體體溫37℃下的活性。根據(jù)蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的線索，研究人員通過4個點位突變，讓酶的活性點位更容易和DNA靶序列接近，從而得到重新設計的新款Cas12b。
與Cas9相比，重新設計的Cas12b在細胞培養(yǎng)實驗中對于靶序列具有更高的特異性。而目標特異性，是指基因剪刀只瞄準那些為它們設定的目標基因，特異性越高則意味著更高的精確性——這對一款功能強大的基因編輯工具來說非常重要。畢竟，脫靶效應是CRISPR技術(shù)最大的隱患之一：Cas9酶有時會在靶點以外的地方進行切割，而這種切割有可能引起腫瘤的發(fā)生，危害健康。
對此，張鋒團隊在細胞培養(yǎng)實驗中，針對多個基因的多個靶序列，考察了新款基因剪刀的編輯效率。實驗結(jié)果顯示，新款Cas12b的編輯效率與Cas9、Cas12a相當，甚至更高；而且，新款Cas12b導致的錯誤插入缺失比常用的Cas9少得多，脫靶率顯著降低。
李偉團隊的研究
中國科學院的李偉團隊是Cas12b基因剪刀研究領域的首發(fā)者，針對這項新技術(shù)，他們已于一年前提交了專利申請，并開始開發(fā)該技術(shù)在基因治療中的應用
不過，張鋒團隊的這款Cas12b基因剪刀還不能算首發(fā)。
2018年11月27日，《細胞發(fā)現(xiàn)》發(fā)表了中國科學院動物研究所研究員李偉團隊的類似研究成果。該研究團隊通過系統(tǒng)挖掘，成功鑒定出若干能在人體生理溫度下工作的Cas12b酶。經(jīng)過系統(tǒng)改造，有兩種Cas12b酶被成功開發(fā)成哺乳動物基因組編輯工具，能夠編輯人類細胞基因組，并應用于制備動物疾病模型。他們開發(fā)的來自酸性脂環(huán)酸芽孢桿菌（AaCas12b）的Cas12b，可以在31℃至59℃溫度范圍內(nèi)對哺乳動物基因組進行編輯。
在那篇論文中，研究者展示了這一工具的三大優(yōu)點：一是Cas12b比應用最為廣泛的SpCas9和Cas12a要更小，因此更容易用于需要在體遞送的臨床基因治療；二是Cas12b能夠在寬廣的溫度范圍和pH范圍保持更高的酶活性，有望適用于具有不同生理溫度的多個物種。同時與SpCas9相比，Cas12b核糖核酸酶（RNP）在人血漿中更穩(wěn)定；三是Cas12b很難耐受向?qū)NA與靶DNA之間的堿基錯配，因此比SpCas9和Cas12a/Cpf1的脫靶效應更小，這意味著它在進行基因組編輯時更加安全。
針對這項新技術(shù)，該研究團隊已于一年前提交了專利申請，并已開始開發(fā)這項技術(shù)在基因治療中的應用。
當然，就像當初Cas9那款基因剪刀的打磨不是由一個團隊完成的那樣，想要將Cas12b改造成和Cas9一樣應用廣泛的工具，仍有很多工作要做。但第三個潛在基因組編輯系統(tǒng)的出現(xiàn)，顯然將會帶給研究人員更多選擇。
CRISPR專利大戰(zhàn)
《經(jīng)濟日報》，2019年2月23日
此前，CRISPR基因編輯技術(shù)因其巨大的商業(yè)價值曾引發(fā)專利大戰(zhàn)。其中最引人注目的是張鋒所在的博德研究所與加州大學伯克利分校之間的專利之爭。由于這兩家機構(gòu)的專利范圍廣，對CRISPR-Cas9的大多數(shù)商業(yè)應用至關(guān)重要。
其中，加州大學伯克利分校提出的專利是不限于任何環(huán)境的CRISPR-Cas9系統(tǒng)，博德研究所的專利主要為真核生物環(huán)境中的CRISPR-Cas9系統(tǒng)。
美國專利商標局專利審判和上訴委員會曾于2017年作出關(guān)鍵裁決：麻省理工學院—哈佛大學—博德研究所的專利，與加州大學伯克利分校的發(fā)現(xiàn)并不“沖突”，博德研究所可以保留其在真核生物中使用CRISPR-Cas9的專利。之后，加州大學伯克利分校提起上訴，2018年，聯(lián)邦巡回上訴法院維持判決。
博德研究所的勝利，是因其專利提出的一個關(guān)鍵區(qū)別：專利指定了CRISPR在真核細胞中的特殊應用，而伯克利的專利卻沒有。這就是為什么美國專利商標局裁定博德研究所的專利不會干擾伯克利的專利，因此可以保留。法官們認為，在張鋒之前沒有研究人員能夠絕對確認CRISPR能用于真核細胞（人類細胞等）。因此，張鋒研究團隊的發(fā)明并非簡單的擴展。而真核細胞的基因編輯領域是CRISPR最有“錢”途的應用。例如，可以通過基因編輯產(chǎn)生新的農(nóng)作物，或是將基因編輯用于人類疾病治療。
值得一提的是，專利判決并不會影響CRISPR-Cas9技術(shù)在科研領域的應用。博德研究所方面稱，全世界的科研人員都可以使用該技術(shù)開展學術(shù)研究，但廠商必須付費使用。
基因編輯為何成為投資“新貴”
本報記者 錢箐旎
《經(jīng)濟日報》，2019年2月23日
日前，中經(jīng)合集團宣布：其早期投資的公司“博雅輯因”完成Pre-B+輪約7000萬元融資，與此同時，擁有豐富臨床經(jīng)驗的李云博士加盟任職臨床研究部副總裁。博雅輯因是一家專注于基因組編輯技術(shù)的生物科技公司，致力于使用基因組編輯技術(shù)為傳統(tǒng)療法難以治愈的疾病開發(fā)新療法，以及為新藥研發(fā)提供創(chuàng)新方案。近年來，基因編輯已成為投資熱點——2018年10月，中經(jīng)合投資的另一家硅谷基因編輯公司也獲得1.1億美元的融資，用以助力全球化市場開拓。
基因治療技術(shù)究竟是什么？其發(fā)展前景如何？專業(yè)人士和資本市場又是如何看待的？
經(jīng)濟日報記者在采訪中了解到，除了一些外源性損傷（物理或化學損傷）和細菌性感染外，人類大多數(shù)疾病的發(fā)生都與基因有關(guān)，比如RPE65基因突變會造成先天性黑蒙癥，21染色體的增加造成唐氏綜合征等。癌癥也是典型的基因病，比如一旦抑癌基因BRCA1發(fā)生遺傳性突變，會導致女性罹患乳腺癌和卵巢癌的概率高達70%。另外，心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及病毒感染（如乙肝、艾滋病）等復雜疾病，都與基因有著密不可分的關(guān)系。
既然如此多的疾病都與基因有關(guān)，那修復基因不就可以從根源上治愈或者預防疾病嗎？這就是基因療法的邏輯和概念。
基因療法是以核酸（脫氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA）為治療物質(zhì)，通過特定的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將治療性核酸輸送到患者細胞中（體內(nèi)或者體外），然后利用這些外源核酸治療由于基因缺失、突變、擴增或異常表達引起的遺傳相關(guān)疾病，如惡性腫瘤、心血管病和傳染病等的治療方法。這些外源核酸通過替代或原位修復缺陷基因，或通過其產(chǎn)物干預致病基因的功能，從而在源頭上根除疾病發(fā)生的原因，或通過其產(chǎn)物改變細胞的生物學特性來幫助治療疾病。
在業(yè)內(nèi)看來，2017年可以說是基因治療元年——FDA（美國食品藥品監(jiān)督管理局）除了批準兩款基于細胞的基因治療藥物外，還批準了首款經(jīng)典的基因療法Luxturna。于2017年12月獲批上市的創(chuàng)新基因療法Luxturna，主要用于治療患有特定遺傳性眼疾的成人患者和兒童，是首款在美國獲批的基于靶向特定基因突變的“直接給藥型”基因療法。
預計未來5年，罕見病處方藥市場將迎來高速發(fā)展，在2024年達到2620億美元，占整個處方藥市場的20%。這主要受益于基因治療和細胞治療等先進生物技術(shù)療法的突破。在不久的將來，還會有一系列基因療法獲得批準上市。
北京大學藥學院天然藥物與仿生藥物國家重點實驗室博士后李帥表示：“對于因基因失活造成的疾病，我們可以利用基因療法為細胞補充相應基因，以實現(xiàn)治療，這是過去大多采用的治療方法。然而，還有很多疾病是由于基因突變而導致的，顯然不適用‘缺什么補什么’的策略。”對此，最理想的基因治療是對突變基因進行精準修復——這就要利用基因編輯技術(shù)。
簡單來說，CRISPR-Cas9是目前為止最強大的基因編輯技術(shù)，可以對DNA進行永久性操作，能夠廣泛應用在臨床、科研、農(nóng)業(yè)、工業(yè)發(fā)酵等領域。而最讓人期待的，就是它在醫(yī)學領域的應用。利用基因編輯技術(shù)的基因療法給予人類無限想象空間，有可能助力癌癥治療，讓人體增強等成為現(xiàn)實，甚至連古人夢寐以求的長生不老也不是遙不可及。當然，現(xiàn)階段這些仍屬想象，每一種技術(shù)都不完美——CRISPR-Cas9仍面臨著效率和脫靶的問題，并且遠非如我們理解的像編輯文字一樣精確。
既然基因編輯技術(shù)具有廣闊前景和市場，目前哪些技術(shù)優(yōu)勢值得重點關(guān)注呢？中經(jīng)合集團董事長劉宇環(huán)表示：“基因治療具有兩個核心，載體和治療性基因。其中，治療性基因以CRISPR系統(tǒng)為主。目前，國內(nèi)的重點關(guān)注方向?qū)⑹菍@個系統(tǒng)在垂直疾病領域的深度應用開發(fā)。”他同時指出，基因載體的安全性和靶向性也是非常重要的研究方向。隨著相關(guān)技術(shù)發(fā)展，甚至可以將離體的基因治療轉(zhuǎn)變?yōu)樵隗w的基因治療，大大增強療法的可及性。此外，基因載體規(guī)模化生產(chǎn)的質(zhì)量控制，以及藥物商業(yè)化等也是決定公司能否快速發(fā)展的關(guān)鍵因素。
“基因編輯技術(shù)還可以賦能現(xiàn)有療法，比如優(yōu)化CAR-T、異種移植、干細胞等技術(shù)。目前，通用型CAR-T療法仍面臨著免疫排斥和移植物抗宿主病的風險，而結(jié)合基因編輯技術(shù)開展研發(fā)，也是未來重要的發(fā)展方向。”中經(jīng)合集團全球醫(yī)療合伙人約翰遜·林強調(diào)。
摘自《經(jīng)濟日報》
