近日，頂級期刊《自然—通訊》發(fā)表論文報道了第三款CRISPR基因剪刀——CRISPR-Cas12b，這種新工具是第三個可以編輯人類細(xì)胞基因組的CRISPR-Cas系統(tǒng)，并很可能是更好的基因剪刀，將會帶給研究人員更多選擇與施展空間
第三款CRISPR基因剪刀論文作者是美國麻省理工學(xué)院—哈佛大學(xué)博德研究所教授張鋒，他也是CRISPR-Cas基因編輯系統(tǒng)的先驅(qū)者之一。此前，他已成功參與開發(fā)出Cas9系統(tǒng)、Cas12a系統(tǒng)，如今成功湊齊Cas12b——CRISPR基因剪刀的第三個潛在基因組編輯系統(tǒng)。
基因剪刀三兄弟
CRISPR-Cas9是目前科學(xué)家們最常用的多功能基因組編輯工具，但除此之外，Cas蛋白家族中的Cas12a和Cas12b也具備成為基因剪刀的潛力
此前，科學(xué)家們在實驗室最常用的多功能基因組編輯工具是CRISPR-Cas9，這是一種RNA導(dǎo)向的核酸酶，可以切割DNA。
Cas9系統(tǒng)最初由美國加州大學(xué)伯克利分校、瑞典于默奧大學(xué)和美國麻省理工學(xué)院—哈佛大學(xué)博德研究所張鋒等實驗室在2012年和2013年報道。該系統(tǒng)有效實現(xiàn)了哺乳動物基因組的編輯，并帶動了基因編輯領(lǐng)域迅猛發(fā)展，將基因編輯技術(shù)成功拓展到基因轉(zhuǎn)錄表達調(diào)控、表觀遺傳修飾、全基因組功能篩選、堿基編輯、基因組成像和細(xì)胞譜系追蹤等多種生物學(xué)應(yīng)用。它能使基因組更有效地產(chǎn)生變化或突變，效率比既往基因編輯技術(shù)更高，這讓CRISPR成為“生物科學(xué)領(lǐng)域的游戲規(guī)則改變者”，如今發(fā)展成為該領(lǐng)域最熱門的研究工具之一。
然而，Cas9并非Cas蛋白家族中唯一一種RNA導(dǎo)向的核酸酶，除了Cas9之外，研究人員還發(fā)現(xiàn)Cas12a和Cas12b也具備成為基因剪刀的潛力。
其中，Cas12a已經(jīng)被開發(fā)成基因組編輯工具。張鋒等人在2015年發(fā)現(xiàn)并改造的Cas12a（又稱為Cpf1）系統(tǒng)能實現(xiàn)哺乳動物等多個物種的基因組編輯。而且與Cas9相比，Cas12a具有一定優(yōu)勢：它比標(biāo)準(zhǔn)的Cas9要小，更容易進入組織和細(xì)胞；它剪切時離識別位點很遠(yuǎn)，這幫助研究人員在編輯位置的選擇上有了更多施展空間。
于是，在CRISPR基因剪刀的潛力者哥仨中，就剩下Cas12b（又稱為C2c1）仍未開發(fā)成功。這種蛋白比Cas9和Cas12a更小，更容易通過病毒載體實現(xiàn)細(xì)胞間遞送，所以很可能是更好的基因剪刀。
張鋒團隊的研究
Cas12b的最佳活性“工作環(huán)境”需要達到48℃，為此，張鋒團隊對Cas12b重新進行了設(shè)計，不但增強它在人體體溫37℃下的活性，甚至在編輯效率和低脫靶率上更為優(yōu)異
理想豐滿，現(xiàn)實骨感。由于Cas12b具有嗜高溫特性，很難開發(fā)成好用的基因編輯工具。作為DNA裂解酶，Cas12b來自一種嗜酸耐熱菌，它的最佳活性“工作環(huán)境”需要達到48℃。這種溫度對于普通哺乳動物來說，實在難以承受。而一旦達不到溫度要求，Cas12b的酶活性就不能發(fā)揮，會選擇罷工。
對此，張鋒團隊對Cas12b開展了研究。他們先在Cas12b蛋白家族中尋找到一種喜歡常溫的成員，并鑒定出在37℃時仍能保持核酸酶活性的BhCas12b。但實驗發(fā)現(xiàn)，原始結(jié)構(gòu)的野生型BhCas12b會切割雙鏈DNA中的非靶標(biāo)單鏈，且溫度越低、錯誤越多，導(dǎo)致編輯效率較低。
為解決這一問題，張鋒團隊對Cas12b重新進行了設(shè)計，以增強它在人體體溫37℃下的活性。根據(jù)蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的線索，研究人員通過4個點位突變，讓酶的活性點位更容易和DNA靶序列接近，從而得到重新設(shè)計的新款Cas12b。
與Cas9相比，重新設(shè)計的Cas12b在細(xì)胞培養(yǎng)實驗中對于靶序列具有更高的特異性。而目標(biāo)特異性，是指基因剪刀只瞄準(zhǔn)那些為它們設(shè)定的目標(biāo)基因，特異性越高則意味著更高的精確性——這對一款功能強大的基因編輯工具來說非常重要。畢竟，脫靶效應(yīng)是CRISPR技術(shù)最大的隱患之一：Cas9酶有時會在靶點以外的地方進行切割，而這種切割有可能引起腫瘤的發(fā)生，危害健康。
對此，張鋒團隊在細(xì)胞培養(yǎng)實驗中，針對多個基因的多個靶序列，考察了新款基因剪刀的編輯效率。實驗結(jié)果顯示，新款Cas12b的編輯效率與Cas9、Cas12a相當(dāng)，甚至更高；而且，新款Cas12b導(dǎo)致的錯誤插入缺失比常用的Cas9少得多，脫靶率顯著降低。
李偉團隊的研究
中國科學(xué)院的李偉團隊是Cas12b基因剪刀研究領(lǐng)域的首發(fā)者，針對這項新技術(shù)，他們已于一年前提交了專利申請，并開始開發(fā)該技術(shù)在基因治療中的應(yīng)用
不過，張鋒團隊的這款Cas12b基因剪刀還不能算首發(fā)。
2018年11月27日，《細(xì)胞發(fā)現(xiàn)》發(fā)表了中國科學(xué)院動物研究所研究員李偉團隊的類似研究成果。該研究團隊通過系統(tǒng)挖掘，成功鑒定出若干能在人體生理溫度下工作的Cas12b酶。經(jīng)過系統(tǒng)改造，有兩種Cas12b酶被成功開發(fā)成哺乳動物基因組編輯工具，能夠編輯人類細(xì)胞基因組，并應(yīng)用于制備動物疾病模型。他們開發(fā)的來自酸性脂環(huán)酸芽孢桿菌（AaCas12b）的Cas12b，可以在31℃至59℃溫度范圍內(nèi)對哺乳動物基因組進行編輯。
在那篇論文中，研究者展示了這一工具的三大優(yōu)點：一是Cas12b比應(yīng)用最為廣泛的SpCas9和Cas12a要更小，因此更容易用于需要在體遞送的臨床基因治療；二是Cas12b能夠在寬廣的溫度范圍和pH范圍保持更高的酶活性，有望適用于具有不同生理溫度的多個物種。同時與SpCas9相比，Cas12b核糖核酸酶（RNP）在人血漿中更穩(wěn)定；三是Cas12b很難耐受向?qū)NA與靶DNA之間的堿基錯配，因此比SpCas9和Cas12a/Cpf1的脫靶效應(yīng)更小，這意味著它在進行基因組編輯時更加安全。
針對這項新技術(shù)，該研究團隊已于一年前提交了專利申請，并已開始開發(fā)這項技術(shù)在基因治療中的應(yīng)用。
當(dāng)然，就像當(dāng)初Cas9那款基因剪刀的打磨不是由一個團隊完成的那樣，想要將Cas12b改造成和Cas9一樣應(yīng)用廣泛的工具，仍有很多工作要做。但第三個潛在基因組編輯系統(tǒng)的出現(xiàn)，顯然將會帶給研究人員更多選擇。
CRISPR專利大戰(zhàn)
《經(jīng)濟日報》，2019年2月23日
此前，CRISPR基因編輯技術(shù)因其巨大的商業(yè)價值曾引發(fā)專利大戰(zhàn)。其中最引人注目的是張鋒所在的博德研究所與加州大學(xué)伯克利分校之間的專利之爭。由于這兩家機構(gòu)的專利范圍廣，對CRISPR-Cas9的大多數(shù)商業(yè)應(yīng)用至關(guān)重要。
其中，加州大學(xué)伯克利分校提出的專利是不限于任何環(huán)境的CRISPR-Cas9系統(tǒng)，博德研究所的專利主要為真核生物環(huán)境中的CRISPR-Cas9系統(tǒng)。
美國專利商標(biāo)局專利審判和上訴委員會曾于2017年作出關(guān)鍵裁決：麻省理工學(xué)院—哈佛大學(xué)—博德研究所的專利，與加州大學(xué)伯克利分校的發(fā)現(xiàn)并不“沖突”，博德研究所可以保留其在真核生物中使用CRISPR-Cas9的專利。之后，加州大學(xué)伯克利分校提起上訴，2018年，聯(lián)邦巡回上訴法院維持判決。
博德研究所的勝利，是因其專利提出的一個關(guān)鍵區(qū)別：專利指定了CRISPR在真核細(xì)胞中的特殊應(yīng)用，而伯克利的專利卻沒有。這就是為什么美國專利商標(biāo)局裁定博德研究所的專利不會干擾伯克利的專利，因此可以保留。法官們認(rèn)為，在張鋒之前沒有研究人員能夠絕對確認(rèn)CRISPR能用于真核細(xì)胞（人類細(xì)胞等）。因此，張鋒研究團隊的發(fā)明并非簡單的擴展。而真核細(xì)胞的基因編輯領(lǐng)域是CRISPR最有“錢”途的應(yīng)用。例如，可以通過基因編輯產(chǎn)生新的農(nóng)作物，或是將基因編輯用于人類疾病治療。
值得一提的是，專利判決并不會影響CRISPR-Cas9技術(shù)在科研領(lǐng)域的應(yīng)用。博德研究所方面稱，全世界的科研人員都可以使用該技術(shù)開展學(xué)術(shù)研究，但廠商必須付費使用。
基因編輯為何成為投資“新貴”
本報記者 錢箐旎
《經(jīng)濟日報》，2019年2月23日
日前，中經(jīng)合集團宣布：其早期投資的公司“博雅輯因”完成Pre-B+輪約7000萬元融資，與此同時，擁有豐富臨床經(jīng)驗的李云博士加盟任職臨床研究部副總裁。博雅輯因是一家專注于基因組編輯技術(shù)的生物科技公司，致力于使用基因組編輯技術(shù)為傳統(tǒng)療法難以治愈的疾病開發(fā)新療法，以及為新藥研發(fā)提供創(chuàng)新方案。近年來，基因編輯已成為投資熱點——2018年10月，中經(jīng)合投資的另一家硅谷基因編輯公司也獲得1.1億美元的融資，用以助力全球化市場開拓。
基因治療技術(shù)究竟是什么？其發(fā)展前景如何？專業(yè)人士和資本市場又是如何看待的？
經(jīng)濟日報記者在采訪中了解到，除了一些外源性損傷（物理或化學(xué)損傷）和細(xì)菌性感染外，人類大多數(shù)疾病的發(fā)生都與基因有關(guān)，比如RPE65基因突變會造成先天性黑蒙癥，21染色體的增加造成唐氏綜合征等。癌癥也是典型的基因病，比如一旦抑癌基因BRCA1發(fā)生遺傳性突變，會導(dǎo)致女性罹患乳腺癌和卵巢癌的概率高達70%。另外，心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及病毒感染（如乙肝、艾滋病）等復(fù)雜疾病，都與基因有著密不可分的關(guān)系。
既然如此多的疾病都與基因有關(guān)，那修復(fù)基因不就可以從根源上治愈或者預(yù)防疾病嗎？這就是基因療法的邏輯和概念。
基因療法是以核酸（脫氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA）為治療物質(zhì)，通過特定的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將治療性核酸輸送到患者細(xì)胞中（體內(nèi)或者體外），然后利用這些外源核酸治療由于基因缺失、突變、擴增或異常表達引起的遺傳相關(guān)疾病，如惡性腫瘤、心血管病和傳染病等的治療方法。這些外源核酸通過替代或原位修復(fù)缺陷基因，或通過其產(chǎn)物干預(yù)致病基因的功能，從而在源頭上根除疾病發(fā)生的原因，或通過其產(chǎn)物改變細(xì)胞的生物學(xué)特性來幫助治療疾病。
在業(yè)內(nèi)看來，2017年可以說是基因治療元年——FDA（美國食品藥品監(jiān)督管理局）除了批準(zhǔn)兩款基于細(xì)胞的基因治療藥物外，還批準(zhǔn)了首款經(jīng)典的基因療法Luxturna。于2017年12月獲批上市的創(chuàng)新基因療法Luxturna，主要用于治療患有特定遺傳性眼疾的成人患者和兒童，是首款在美國獲批的基于靶向特定基因突變的“直接給藥型”基因療法。
預(yù)計未來5年，罕見病處方藥市場將迎來高速發(fā)展，在2024年達到2620億美元，占整個處方藥市場的20%。這主要受益于基因治療和細(xì)胞治療等先進生物技術(shù)療法的突破。在不久的將來，還會有一系列基因療法獲得批準(zhǔn)上市。
北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物與仿生藥物國家重點實驗室博士后李帥表示：“對于因基因失活造成的疾病，我們可以利用基因療法為細(xì)胞補充相應(yīng)基因，以實現(xiàn)治療，這是過去大多采用的治療方法。然而，還有很多疾病是由于基因突變而導(dǎo)致的，顯然不適用‘缺什么補什么’的策略。”對此，最理想的基因治療是對突變基因進行精準(zhǔn)修復(fù)——這就要利用基因編輯技術(shù)。
簡單來說，CRISPR-Cas9是目前為止最強大的基因編輯技術(shù)，可以對DNA進行永久性操作，能夠廣泛應(yīng)用在臨床、科研、農(nóng)業(yè)、工業(yè)發(fā)酵等領(lǐng)域。而最讓人期待的，就是它在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。利用基因編輯技術(shù)的基因療法給予人類無限想象空間，有可能助力癌癥治療，讓人體增強等成為現(xiàn)實，甚至連古人夢寐以求的長生不老也不是遙不可及。當(dāng)然，現(xiàn)階段這些仍屬想象，每一種技術(shù)都不完美——CRISPR-Cas9仍面臨著效率和脫靶的問題，并且遠(yuǎn)非如我們理解的像編輯文字一樣精確。
既然基因編輯技術(shù)具有廣闊前景和市場，目前哪些技術(shù)優(yōu)勢值得重點關(guān)注呢？中經(jīng)合集團董事長劉宇環(huán)表示：“基因治療具有兩個核心，載體和治療性基因。其中，治療性基因以CRISPR系統(tǒng)為主。目前，國內(nèi)的重點關(guān)注方向?qū)⑹菍@個系統(tǒng)在垂直疾病領(lǐng)域的深度應(yīng)用開發(fā)。”他同時指出，基因載體的安全性和靶向性也是非常重要的研究方向。隨著相關(guān)技術(shù)發(fā)展，甚至可以將離體的基因治療轉(zhuǎn)變?yōu)樵隗w的基因治療，大大增強療法的可及性。此外，基因載體規(guī)模化生產(chǎn)的質(zhì)量控制，以及藥物商業(yè)化等也是決定公司能否快速發(fā)展的關(guān)鍵因素。
“基因編輯技術(shù)還可以賦能現(xiàn)有療法，比如優(yōu)化CAR-T、異種移植、干細(xì)胞等技術(shù)。目前，通用型CAR-T療法仍面臨著免疫排斥和移植物抗宿主病的風(fēng)險，而結(jié)合基因編輯技術(shù)開展研發(fā)，也是未來重要的發(fā)展方向。”中經(jīng)合集團全球醫(yī)療合伙人約翰遜·林強調(diào)。
摘自《經(jīng)濟日報》
